АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР
ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ПСИХИЧЕСКОГО ЗДОРОВЬЯ
На правах рукописи
ТАШМАТОВ БАХОДИР АБДУРАХИМОВИЧ
КЛИНИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ
МЕМБРАНОАКТИВНОГО БЕЛКА СЫВОРОТКИ
КРОВИ БОЛЬНЫХ ШИЗОФРЕНИЕЙ
14.00.18 — «Психиатрия»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
МОСКВА- 1991 ГОД
Работа выполнена на кафедре психиатрии Ташкентского государственного медицинского института (ректор-профессор Даминэв Т. А., зав. кафедрой - профессор Алимов X. А.), в лаборатории «Биофизика клетки» Института физиологии АН УзССР (директор-академик АН УзССР Ташмухамедов Б. А.) и Институте химии растительных веществ АН УзССР (директор-профессор Арипов X. Н.)
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Вертоградова О. П.
доктор биологических наук, профессор Лидеман Р. Р.
доктор медицинских наук, профессор Стукалова Л. А.
Ведущее учреждение — Всесоюзный научно-исследовательский институт общей и судебной психиатрии им. В. П. Сербского МЗ СССР.
Защита состоится «11» марта 1991 г. на заседании специализированного совета Д 001.30.01 при Всесоюзном научном центре психического здоровья АМН СССР по адресу: Москва, Каширское шоссе, 34.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНЦПЗ АМН СССР.
Автореферат разослан «» 1991 г.
Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук
ЛОСЕВА Т. М.
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Фундаментальные достижения в области биологии, биохимии, биофизики существенно повлияли на
развитие исследований в области психиатрии и привели к появлению биологического направления изучения патогенеза шизофрении. Благодаря биологическим поискам сущности шизофрении было
выявлено, что кровь больных шизофренией способна изменять поведение тренированных крыс J.R.Bergen, 1967; С.A.Д Winter и
L.Flataker ,1963), вызывать психические расстройства у здоровых добровольцев (R&.Heath, 1954), приводить к гемолизу куриных эритроцитов и увеличению коэффициента лактат/пируват
(С.Е.Frohman, 1967; А.В.Снежневский и М.Е.Вартанян, 1975;
Д.В.Лозовский, 1971). Поиски причин указанных нарушений привели к обнаружению в крови больных шизофренией белкового вещества - "фактора плазмы" или "сывороточного фактора". Дальнейшее
изучение свойств биологически активного сывороточного фактора
показало универсальность его действия, которая выражалась в
способности повреждать клеточные мембраны (Р.Р.Лидеман, 1972;
Г.И.Коляскина, 1975; И.В.Домашнева, 1971; Е.И.Солнцева, 1973;
Л.Л.Прилипко, 1982).
Попытки исследователей, направленные на выделение из крови больных шизофренией сывороточного фактора и изучение его физико-химической природы, не увенчались успехом. Несмотря набольшую интенсивность этих исследований, они не привели к обнаружению "шизофренического токсина". С одной стороны, полученные результаты, по целому ряду причин оказались весьма неоднозначными, а порой и диаметрально противоположными, с другой стороны, до настоящего времени остается неясным вопрос о роли и месте сывороточного фактора в этиопатогенезе шизофрении, источнике его происхождения и в какой степени сывороточный фактор сопровождает болезнь на всем ее протяжении. Еще более разноречивы мнения исследователей о механизме действия сывороточного фактора на мозговые структуры.
Отсутствие единой точки зрения на проблему сывороточного фактора, на наш взгляд, объясняется, во-первых, тем, что, в исследованиях, направленных на поиск специфической, биологически активной белковой субстанции, имеющей определенное значение в патогенезе шизофрении, применялась цельная сыворотка. Во-вторых, используемые для решения проблемы сывороточного фактора тест-системы были биологически неоднородными, что также приводило к неоднозначным результатам.
Таким образом, проблема сывороточного фактора переросла в значительно более широкую проблему биологических особенностей сыворотки крови при шизофрении.
Необходимо подчеркнуть, что важность изучения природы шизофрении диктуется ее распространенностью, тяжестью течения, неблагоприятным исходом с ранней инвалидизацией. Поэтому изучение сущности этого заболевания имеет очень большое значение для решения принципиальных практических и теоретических вопросов психиатрии.
Тема диссертации входит в государственную программу научных исследований (государственная регистрация № 01860036328,
шифр 27.01).
Цель исследования. Основная цель настоящей работы заключалась в выделении из сыворотки крови больных шизофренией белковой субстанции, обладающей биологической (мембранной) активностью, и ее клинико-биологическое изучение.
Задачи исследования.
В соответствии с поставленной целью основные задачи исследования сводились к следующему:
- Выделение из сыворотки крови больных шизофренией белкового вещества, биологическая активность которого выявлялась при помощи надежной тест-системы, позволяющей количественно оценивать степень биологической активности в зависимости от клинического состояния больных.
- Исследование мембраноактивных свойств сывороточного белка больных различными клиническими формами и типами течения шизофренического процесса.
- Влияние коррелятивной связи между результатами исследования мембраноактивных СВОЙСТВ сыворотки крови больных шизофренией и основными клиническими характеристиками заболевания, имея в виду клиническую форму и тип течения.
- Изучение физико-химических свойств мембраноактивного белка сыворотки крови больных шизофренией, включающее определение молекулярной массы, аминокислотного состава, термолабильности, спонтанной инактивации вторичной структуры.
Научная новизна работы.
Научная новизна работы определяется ее основными результатами, В работе впервые в психиатрии использован метод выявления биологической активности при помощи искусственных бислойных липидных мембран, являющихся моделью биологических мембран, и метод изучения вторичной структуры мембраноактивного белка больных шизофренией при помощи спектрополяриметра.
В процессе выделения из крови больных шизофренией мембраноактивного белка был получен белок с высокой степенью чистоты.
Гомогенность его доказана как методом аналитического электрофореза в полиакриламидном геле, так и определением NH2-концевой аминокислоты. Это позволило определить молекулярную массу и аминокислотный состав этого белка.
Кроме того, в работе показано, что мембраноактивный белок является двухкомпонентным белковым соединением. Используя молекулярные фильтры, удалось разделить низкомолекулярную часть от высокомолекулярной. Доказано, что низкомолекулярный компонент белка является ответственным за мембранную активность, тогда как высокомолекулярный компонент такой активностью не обладал.
В диссертации впервые изучены физико-химические особенности низкомолекулярного компонента мембраноактивного белка - молекулярная масса, аминокислотный состав, вторичная структура, способность к каналообразованию в мембранах. По уровню, результаты диссертации являются новыми, имеющими важное народнохозяйственное значение. Теоретическая и практическая значимость. В работе выявлена способность глобулиновой фракции сыворотки крови больных шизофренией увеличивать удельную проводимость бислойной липидной мембраны (БЛМ), интенсивность которой зависит от клинических параметров заболевания. Указанной способностью глобулиновая фракция сыворотки крови больных другими психозами и здоровых лиц не обладала. Эти различия могут служить дополнительным тестом для диагностики шизофрении.
Кроме того, выявленные в работе различные показатели биологической активности сывороточного фактора при различных конических проявлениях заболевания позволяют логично обосновывать существующую верификацию шизофрении.
Изучение мембраноактивного белка позволило доказать его двухкомпонентность и исследовать физико-химические свойства низкомолекулярного компонента белка. В работе показано, что в низкомолекулярном компоненте происходят существенные информационные перестройки и наблюдается ярко выраженное изменение вторичной структуры этого компонента. Эти данные указывают на высокую ценность результатов диссертации.
Реализация (внедрение). Результаты работы имеют прикладное значение и могут быть использованы в масштабах отрасли.
Метод изучения мембраноактивных свойств сывороточного белка больных шизофренией при помощи БЛМ, являющихся надежной тест-системой, может быть рекомендован для его использования во всех биохимических лабораториях психиатрических учреждений. Результаты исследования этим методом могут служить дополнительным критерием для комплексной диагностики шизофрении.
Кроме того, выявленные с помощью спектрополяриметра выраженные конформационные сдвиги в структуре низкомолекулярного компонента сывороточного белка больных шизофренией требуют дальнейшего более глубокого изучения с поиском причины этого феномена.
Продолжение научных исследований по указанной проблеме осуществляется на кафедре психиатрии Ташкентского государственного медицинского института № I, Институте физиологии АН УзССР и Институте химии растительных веществ АН УзССР.
Апробация диссертации. Материалы диссертации доложены на научно-практической конференции врачей Городской клинической психиатрическое больницы ГУЗ Ташгорисполкома (1986 год), на заседании Республиканского научного общества невропатологов и психиатров Узбекистана (1987 год), на П съезде невропатологов и психиатров Узбекистана (1987 год), на Международном симпозиуме молодых ученых, посвященном вопросам судебной психиатрии -ВНИИ общей и судебной психиатрии им. В.П.Сербского (стендовый доклад, 1988 год).
Публикации.
Материалы диссертации опубликованы в восьми научных статьях в республиканских и центральных изданиях.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 200 страницах машинописного текста, из них 162 страницы основного текста. Она состоит из введения, обзора литературы, глав собственного исследования, заключения, выводов, перечня использованной литературы и приложения. Библиографический указатель включает 185 отечественных и 127 зарубежных работ. Всего использовано 312 литературных источников. Работа иллюстрирована 26 рисунками и 4 таблицами.
Материал и методы исследования. Были обследованы 104 больных различными клиническими формами и типом течения шизофрении, 15 больных психозами нешизофренической этиологии и 37 практически здоровых лиц. Клиническое наблюдение и исследование больных проводилось в Городской клинической психиатрической больнице Главупрздрава Ташгорисполкома в период с 1979 года по 1990 год.
Для обследования были взяты только те больные, у которых психический статус в момент госпитализации характеризовался продуктивной симптоматикой и где можно было в первую очередь думать о шизофреническом процессе, Уточнение особенностей течения и состояния больных в каждом случае осуществлялось автором после исследования сыворотки крови.
Оценка формы заболевания и статуса больного проводилась в соответствии с классификацией форм шизофрении, предложенной А.В.Снежневским и сотрудниками Института психиатрии АМН СССР (1960,1975,1985 гг.). Согласно этой классификации, клинический материал, представленный больными шизофренией, характеризовался типом течения и клиническими проявлениями, при-водимыми в таблице I.
Вторую группу исследованных составили 15 больных, из которых у 8 был диагностирован алкогольный делирий. У остальных 7 больных при госпитализации предполагалась шизофрения, но в процессе клинического наблюдения и исследования этот диагноз был исключен.
Третья группа была представлена практически здоровыми. Это - студенты медицинского института и медицинские работники.
Для выделения из сыворотки крови больных шизофренией биологически активного сывороточного белка и аналогичного белка у представителей П- и Ш групп был использован метод ионообменной хроматографии на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой (Т.Дэвени, Я. Гергей, I97S).
Для очистки биологически активной белковой фракции и получения сывороточного α2-глобулина в очищенном виде использовался метод ппепапативного диск-электрофореза (Г.Маурер, 1971).
Таблица № 1
Клиническая характеристика обследованных больных шизофренией
Тип течения |
Клинические проявления (симптоматика) |
Кол-во больных |
Муж. |
Жен. |
повторн. госпит. |
наслед. отягощ. |
Инвалид- ность |
I.Непрерывно- прогредиентный |
|
75 72,1% |
51 68,0% |
24 32,0% |
51 63,0% |
28 37,3% |
34 45,3% |
1. Вялотекущая шизофрения |
1.Неврозоподобная |
5 |
3 |
2 |
2 |
1 |
- |
2.Паранойяльная |
12 |
8 |
4 |
7 |
3 |
- |
|
2.Умеренно-прогредиентная |
Галлкщинаторно-параноидная: |
|
|
|
|
|
|
А.Галлюцинаторный вариант |
23 |
12 |
11 |
15 |
9 |
10 |
|
Б.Бредовой вариант |
18 |
15 |
3 |
12 |
7 |
10 |
|
3.Злокачественная |
1.Гебефреническая |
8 |
5 |
3 |
7 |
5 |
6 |
Конечные (исходные) состояния |
9 |
8 |
1 |
8 |
3 |
8 |
|
II.Присутпообразно- прогредиентный (шубообразная) |
1.Параноидная |
19 18,2% |
11 57,9% |
8 42,1% |
12 63,2% |
7 36,8% |
6 18,2% |
|
|
|
|
|
|
||
III. Периодический (рекуррентный) |
I. Кататоно-онейроидная |
10 9,6% |
6 60% |
4 40% |
2 20% |
1 10% |
- |
ИТОГО: |
104 |
68 |
36 |
65 |
36 |
40 |
Гомогенность мембраноактивного белка - α2-глобулина определяли методом аналитического электрофореза в полиакри- . ламидном геле (Г.Маурер, 1971), способностью вызывать анти-тела (Т.Дэвени, Я.Гергеи, 1976) и методомопределения NH2-концевой аминокислоты (Protein sequence dermination, 1975).
В качестве теста для выявления биологической активности сывороточного α2-глобулина были использованы искусственные бислойные фосфолипидные мембраны - БЛМ (R.Mueller, D.Rubin, 1963).
Для разделения мембраноактивного белка и аналогичного белка здоровых людей на двухкомпонентную систему использовали мембранные концентраторы ФМ-2 отечественного производства с молекулярными фильтрами "Владипор" различной разрешающей способности.
Для определения физико-химических свойств мембраноактивного α2-глобулина использовали аминокислотный анализатор., фирмы "Бекман" (США) и спектрополяриметр Jasep J. (Япония).
Статистическую обработку полученных результатов исследований проводили параметрическим методом.
Выделение мембраноактивного белка из сыворотки крови больных шизофренией.
Для выделения биологически- активного белка из сыворотки крови больных шизофренией были использованы классические методы аналитической химий белка: ионообменная хроматография на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, препаративный и аналитический электрофорез.
Для ионообменной хроматографии использовалась порошкообразная ДЭАЭ-целлюлоза ДЭ-32 фирмы "Peaнал" (ВНР). Подготовленной к работе целлюлозой заполняли колонку, размером I х 60 см.
Хроматография проводилась по методу Т.Дэвени и Я.Гергей (1976). Полученные 4 белковые фракции больных шизофренией, другими психозами и здоровых лиц были исследованы на наличие биологической активности. Было выявлено, что только III белковая фракция сыворотки крови больных шизофренией обладала мембрано-активными свойствами, проявляющимися в способности увеличивать удельную проводимость искусственных бислойных липидных мембран (БЛМ).
Изучение гомогенности биологически активной 3 белковой фракции, содержащей в основном α -глобулины, больных шизофренией и неактивной у больных другими психозами и здоровых яиц при помощи аналитического электрофореза в полиакриламидном геле показало, что эта фракция является смесью разнородных белков.
Дальнейшая очистка Ш белковой фракции проводилась при помощи препаративного диск-электрофореза у 86 больных шизофренией, 6 больных другими психозами и 21 здорового. В результате был выделен гомогенный белок, сохранявший мембраноактивные свойства у больных шизофренией.
Как известно, гомогенность изучаемого материального-субстрата является самым первым и необходимым условием для изучения его структуры. В связи с этим, гомогенности полученного белка придавалось особое значение. Гомогенность мембраноактивного белка проверялась тремя параллельными способами: анали-. тическим электрофорезом в полиакриламидном геле, определением свободного NH2 -конца в молекуле белка и количеством линий преципитации при двойной двумерной диффузии в агаровом геле по Ухтерлони, после получения иммунной сыворотки у кроликов.
Исследования показали, что полученный после препаративного диск-электрофореза белок, мембраноактивный у больных шизофренией и неактивный у больных другими психозами и здоровых лиц, является гомогенным. По своей электрофоретической подвижности указанный белок относится к группе α2-глобулина.
Выбор и использование тест-системы для выявления мембраноактивных свойств сывороточного белка больных шизофренией.
В отечественной и зарубежной литературе описано много способов обнаружения биологической активности сывороточных белков больных шизофренией. Так, биологическую активность "фактора плазмы" некоторые исследователи выявили по снижению скорости взбегания обученных крыс но отвесной веревке, возникновению психических расстройств у здоровых добровольцев, гемолизу куриных эритроцитов и связанных с ним увеличением коэффициента лактат/пируват.
Работами отечественных исследователей было выявлено, что в основе упомянутых многоплановых эффектов лежит способность сывороточных белков больных шизофренией повреждать, прежде всего мембраны клеточных и субклеточных структур.
Не умаляя достоинств каждого метода исследований, следует все же сказать,_ что некоторые из них отличались недостаточной информативностью, трудностью дифференциации и проведения корреляции полученных результатов с различными клиническими проявлениями и течением шизофренического процесса..
Кроме того, результаты исследований некоторыми указанными методами вызывали определенные трудности в цифровых выражениях, способных максимально объективизировать верификацию шизофрении.
Все изложенное послужило причиной поиска новых, современных методов выявления биологической активности сыворотки крови больных шизофренией. В своем поиске такого метода, мы руководствовались доказанной способностью сывороточных белков больных шизофренией повреждать клеточные мембраны.
Р.Мюллер с соавторами (1963) впервые выявили, что липиды, спонтанно образующие ламеллярные слои, способны формировать бислойные структуры на небольших отверстиях в тонких гидрофобных материалах. Авторы с помощью простой электроизмерительной техники охарактеризовали важнейшие электрические параметры этих мембран, получивших название бислойных липидных мембран - БЛМ. Было обнаружено, что по своим электрическим характеристикам и ряду других физико-химических свойств, БЛМ близки к биологическим мембранам.
В психиатрической литературе каких-либо указаний на использование этого метода для выявления биологической активности сывороточных белков больных шизофренией обнаружено не было.
В специальной литературе имеются сообщения о многих биологически активных соединениях, вызывающих изменение проводимости БЛМ. При сопоставлении результатов исследования мембраноактивных свойств Ш белковой фракций сыворотки крови больных шизофренией и данными литературы по изучению биологически активных соединений методом БЛМ, можно видеть, что в обоих случаях отмечается изменение проводимости БЛМ.
Таблица 2
Сравнительная характеристика увеличения проводимости БЛМ при воздействии мембраноактивных веществ и Ш белковой фракции сыворотки крови больных шизофренией
Вещество |
Концентрация (М) |
Удельная проводимость (q)БЛМ: ом--1 см -2 |
Контроль (Ш белковая фракция сыворотки крови здоровых лиц) |
1,0•10 -5 |
2,34•10 -10 |
ЦТАБ (цетилтриметиламмония бромид) |
1,0•10 -5 |
(1,4±0,2)•10 -6 |
АНС (1-анилино-8-нафта-линсульфонат) |
3,0•10 -5 |
(5,4±0,5)•10 -7 |
ЛК (линолевая кислота) в н-декак |
4,2•10 -1 |
(1,0±0,3)•10 -7 |
Яд паука Steatoda Paykulliana |
1,0•10 -5 |
(5,0±0,3)•10 -5 |
Грамицидин А |
4,0•10 -6 |
(1,8±0,5)•10 -5 |
Аламетицин |
4,0•10 -6 |
(3,2±0,3)•10 -4 |
Ш белковая фракция сыворотки крови больных шизофренией |
1,0•10 -5 |
(1,7±0,3)•10 -9 |
Как видно из приведенных данных, Ш белковая фракция сыворотки крови больных шизофренией обладает такими же мембраноактивными свойствами, что и известные биологически активные соединения. Это и послужило причиной окончательного выбора метода бислойных липидных мембран в качестве тест - объекта для выявления мембранотропной активности сыворотки крови больных шизофренией.
Результаты собственных исследований и клинико-биологические корреляции.
Для изучения мембраноактивных свойств 3 белковой фракции и гомогенного α2 -глобулина сыворотки крови больных шизофренией использовались БЛМ, полученные по методу Р.Мюллера с соавторами (1963). Для измерения электропроводимости БЛМ применялась электрическая схема, описанная Е.А.Либерманом (1970).
В среде, содержащей 100 мМ KCL и 5 мМ TPИС-HCL ,pH 7,5, проводимость БЛМ без сывороточных белков составляла 1-2,34•10-10ом-1см-2.
Во всех случаях после добавления в среду 2,0 мл концентрированной на роторном испарителе Ш белковой фракции больных шизофренией наблюдалось увеличение удельной проводимости БЛМ почти на I порядок ( 4,6±0,5•10-9ом-1см-2). Аналогичные изменения проводимости БЛМ, индуцированной Ш белковой фракцией больных шизофренией, наблюдались и в присутствии в среде ионов натрия.
Результаты исследования мембраноактивных свойств Ш белковой фракции больных шизофренией в зависимости от типа течения и клинических проявлений представлена в таблице 3.
Тип течения и клинические проявления