ВОЗМОЖНАЯ РОЛЬ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ГЛИИ В ПОВРЕЖДЕНИИ И ГИБЕЛИ НЕЙРОНОВ В ПРОЦЕССЕ СТАРЕНИЯ
В. А. Зуев1, И. В. Викторов2, Н. П. Бородина1, Н. Г. Игнатова1, С. И. Быковская1, А. С. Халанский3
1НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН, Москва ^Институт мозга РАМН, 3ЭНИИ морфологии человека РАМН, Москва
Открытие в начале 80-х гг. нашего столетия инфекционных прионных белков поставило на твердую этиологическую основу особую группу медленных инфекций человека и животных, известных под названием «трансмиссивные губкообразные энцефалопатии» (ТГЭ). Оказалось, что и ТГЭ человека (болезнь Крейтцфельда-Якоба, куру, синдром Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, смертельная семейная бессонница) и ТГЭ животных (скрепи, трансмиссивная энцефалопатия норок, хроническая изнуряющая болезнь оленей и лосей, губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота, губкообразная энцефалопатия кошек, губкообразная энцефалопатия экзотических копытных) вызывают безнуклеиновые низкомолекулярные белки, инфекционные свойства которых сочетаются с высокой устойчивостью к УФ-свету, проникающей радиации, повышенной температуре и переваривающему действию протеазы К. Такие белки получили наименование «инфекционные прионные белки» [1].
Как оказалось, инфекционный прионный белок (PrPSc) является производным от его нормальной клеточной изоформы, обозначенной как РгРс. Последний играет важную роль в жизнедеятельности организма, участвуя в процессе передачи нервных импульсов в синапсах, а главное — в поддержании так называемых «циркадианных» (околосуточных) ритмов в клетке, в органе и в организме в целом. Синтез белка РгРс продолжается в течение всей жизни и наиболее высокие концентрации и-РНК для этого белка обнаруживаются в нейронах, астроцитах и олигодендроцитах [2,3]. Нарушение синтеза РгРс влечет за собой глубокие нарушения в мозге, особенно в таламической области, и выражаются в прогрессирующем сокращении продолжительности сна, что в конечном итоге и составляет главный признак смертельной семейной бессонницы (ССБ), которая, как всякая прионная болезнь, заканчивается смертельным исходом. Ген, кодирующий РгРс, расположен в коротком плече хромосомы 20 у человека и хромосомы 2 у мыши [1].
Конверсия РгРс в PrPSc представляет собой посттрансляционный процесс, включающий глубокие конформационные изменения, которые и являются фундаментальным событием, лежащим в основе размножения инфекционных прионов. В этом случае речь идет об изменении третичной или даже четвертичной структуры исходного клеточного белка РгРс. Таким образом, процесс накопления инфекционного прионного белка происходит не в результате синтеза в зараженном организме новых молекул PrPSc, а вследствие конформационных изменений уже синтезированных нормальных молекул РгРс под влиянием молекул инфекционного прионного белка PrPSc [1].
Абсолютная доказанность накопления инфекционных прионных белков в организме при всех четырех ТГЭ у человека и при всех шести ТГЭ у животных позволила именовать эти смертельные страдания как «прионные болезни» [4]. Сами прионные болезни также весьма существенно отличаются от всех известных инфекционных заболеваний тем, что они могут проявляться и как спорадические, и как наследственные, и как инфекционные. Хорошим примером этому служит болезнь Крейтцфельда-Якоба (БКЯ), при которой из 100 % заболевающих в 85 % случаев болезнь возникает как спорадическая у людей 40-69-летнего возраста; в 10-15 % случаев — как наследственное заболевание и менее, чем в 1-5 % случаев эта болезнь развивается как инфекционная, т. е. в результате типичного внешнего заражения, связанного с медицинскими манипуляциями или пересадками тканевых материалов от человека к человеку (ятрогенные случаи заболевания) [5].
Все без исключения прионные болезни человека и животных отличаются характерными патогистологическими изменениями, затрагивающими лишь головной, а иногда и спинной мозг. Они проявляются в выпадении нейронов, формировании губкообразного состояния в белом и/или сером веществе головного, а иногда и спинного мозга, с образованием амилоидных бляшек и глиозом. При различных прионных заболеваниях соотношение этих признаков подвержено заметным колебаниям. Так, например, при БКЯ амилоидные бляшки встречаются в 9 % случаев, а при куру они наблюдаются в 70 %. Однако такой признак, как глиоз отмечается всеми авторами практически постоянно во всех случаях заболеваний и даже при ССБ, при которой порой бывает нелегко обнаружить признаки спонгиоза, но при микроскопическом исследовании медиодорзального и передневентрального ядер таламуса на первый план всегда выступают потеря нейронов и астроглиоз [6, 7].
На протяжении многих лет изучения повреждений центральной нервной системы (ЦНС) при прионных болезнях интерес исследователей, как правило, сосредоточивался вокруг таких вопросов, как природа и химизм бляшек, их топография, равно как и топография формирования участков спонгиоза, механизм гибели нейронов, связь характера и особенностей повреждения в ЦНС с характером мутационных изменений в гене PRNP. Вместе с тем, казалось само собой разумеющимся, что последовательность патогистологических изменений в мозговой ткани должна подчиняться общебиологической логике, когда наблюдаемый процесс выпадения нейронов рассматривается в качестве изначального признака проявления патологии, вслед за которым начинается формирование спонгиоза и отложение амилоида. Замыкать все эти события должна реакция глиозной ткани, как бы призванная замещать дефекты, возникающие в результате все увеличивающейся гибели нейронов [8].
Однако в последние годы наметился определенный интерес к роли глии в этом многоэтапном процессе повреждения клеток ЦНС под действием инфекционного и не только инфекционного белка. Так, начиная с конца 80-х гг. нашего столетия иммуноцитохимическими и ультраструктурными исследованиями было показано, что элементы глии оказываются вовлеченными в процесс фагоцитоза амилоидных фибрилл при болезни Альцгеймера (БА) [9,10], с одной стороны, а с другой — они способны принимать непосредственное участие в формировании амилоидных фибрилл при экспериментальной БКЯ и при БА [11, 12]. Позднее эти данные были подтверждены, когда обнаружилась активированная микроглия при экспериментальной скрепи у мышей, участвующая в процессе отложения амилоида [13]. Тогда же в лаборатории К. Гайдушека была экспериментально продемонстрирована вариабельная, но важная роль микроглии в процессе образования амилоидных бляшек при прионных болезнях и высказано мнение, что наблюдаемая вариабельность отражает специфическую связь ее с данной нозологической формой и реализуется на уровне синтеза и-РНК для белка-предшественника скрепиассоциированного амилоида [14].
Недавно эти исследования получили неожиданное продолжение в ряде работ, посвященных изучению механизмов смерти нейронов. Прежде всего было показано, что синтетический пептид 106-126, гомологичный по своим последовательностям амилоидному белку, выделенному из мозговой ткани пациента, погибшего от синдрома Герстманна-Штреусслера-Шейнкера (СГШШ), при внесении в культуру нейронов и астроцитов вызывает гибель первых по типу апоптоза и выраженную пролиферацию и гипертрофию — вторых [15]. Более того, указанный выше пептид 106-126, как оказалось, способствует формированию амилоидных фибрилл в условиях in vitro и является токсичным для культуры нейронов только при условии одновременного присутствия микроглии, которая отвечает на присутствие пептида 106-126 повышением в ней содержания окислительных радикалов [16].
Прямой анализ последовательности событий в мозге при скрепи у мышей показал, что активация глии и последующая иммунореактивность цитокинов в ходе развития болезни наступает значительно раньше, чем развитие спонгиоза. Начало продукции цитокинов, активированной глией, предшествует процессу апоптоза нейронов [17]. Сходные события были описаны несколько ранее при БА, когда было выявлено иммуноареактивное воздействие глии на такие цитокины, как ИЛ-1, ИЛ-6 и связанный с ними процесс накопления амилоидных бляшек [18]. Поэтому высказывается предположение о том, что при скрепи, равно как и при БА, процесс выпадения нейронов опосредован продуктами активации глии [19, 20].
Наконец, еще один довольно своеобразный подход также подтверждал важную роль глии в прионной патологии. Так, R. Demaimay и соавт. [21], обрабатывая зараженных скрепи мышей амфотерицином В или его менее токсичным дериватом, показали, что увеличение продолжительности жизни животных под действием препаратов сопровождалось замедлением отложения в мозговой ткани PrPsc, что сочеталось со снижением гиперэкспрессии специфического для астроцитов кислого глиального фибриллярного белка.
Почти 30 лет назад начало формироваться мнение о весьма выраженном сходстве мозговых нарушений в процессе старения с мозговыми изменениями при ТГЭ. И главной отправной точкой при этом оказались уже упомянутые выше патоморфологические находки при ТГЭ. Строгое единообразие этих изменений, наблюдаемых, например, в организме зараженных скрепи мышей, не могло не обратить внимания исследователей на их поразительное сходство с патогистологическими изменениями в организме стареющих мышей. Между тем, еще в 1970 г. было установлено, что в организме стареющих мышей ткань мозга характеризуется гибелью нервных клеток, разрастанием глии и формированием амилоидных бляшек. Вскоре подобные же изменения были описаны и в ткани мозга старых собак, и обезьян [22]. С течением времени изменения в тканях мозга, напоминающие черты патогистологии при куру, БКЯ, СГШШ, были выявлены в мозге людей, страдающих БА, старческим слабоумием и даже у внешне здоровых пожилых людей [23, 24].
Не вдаваясь в анализ уже достаточно многочисленной литературы, заметим лишь, что сходство в картине повреждений мозга при старении и при прионных болезнях дает основание предполагать важную роль элементов глии в первом случае, как это все более убедительно демонстрируется во втором. Тем более, что ген, кодирующий синтез предшественника амилоида при БА, естественном старении и болезни Дауна, является единственным, детерминирующим синтез этого соединения и он, как и прионный ген, высоко консервативен и каптирован [25].
Именно поэтому нами высказывается предположение о возможном накоплении в мозговой ткани стареющих млекопитающих, включая и человека, какого-то фактора (или факторов), активно стимулирующего пролиферацию глии, что может послужить существенным элементом в генезе морфологических изменений, включая нарушение трофики нейронов, которое, в свою очередь, может послужить причиной их гибели и в конечном счете причиной гибели мозга в целом.
Приступая к экспериментальной проверке высказанного предположения, мы на первом этапе исследований поставили целью проанализировать в условиях клеточных культур возможность накопления в стареющем мозге млекопитающих фактора, способного стимулировать пролиферацию глии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Культура первично-трипсинизированных глиальных клеток. Измельченный головной мозг 3-5-дневных мышей линии C57BL/6 помещали в 0,25 % раствор трипсина при 37°С на 10 минут, после чего клетки осаждали центрифугированием, трижды отмывали в среде Игла Д-МЕМ, а затем пипетировали в ростовой среде следующего состава: среда Игла Д-МЕМ+глютамин (3 %)+ эмбриональная телячья сыворотка (10 %)+ +HEPES (1 %)+ антибиотики.
10-дневный монослой глиальных клеток перевивали по общепринятой методике с помощью 0,2 % раствора версена. Исходная концентрация клеток в суспензии составляла 200 тыс./мл. Диссоциированные глиальные клетки культивировали в пробирках Лейтона на покровных стеклах в той же среде с добавлением стерильного экстракта мозга мышей. Снятие клеток со стекол осуществляли с помощью 0,2 % раствора версена и их количество подсчитывали в камере Горяева.
Перевиваемые линии клеток. Использовали линии ЭПНТ-5 (эпендимобластома мыши) и НГУК-2 (невринома Гассерова узла крысы), любезно предоставленные А. С. Халанским (НИИ морфологии человека РАМН). Клетки культивировали в ростовой среде вышеописанного состава по общепринятой методике.
Приготовление мозговых экстрактов. 25 % экстракты мозга мышей получали путем растирания мозговой ткани мышей с электрокорундом в фарфоровой ступке в присутствии 3 частей ростовой среды (см. выше). Суспензию осветляли центрифугированием при 3 тыс. об./мин в течение 10 минут. Над осадочную жидкость пропускали через фильтры Millipor (0,45 мк). В опытах использовали экстракты, полученные из мозговой ткани 2-месячных (молодой мозг) и 1 5-го-довалых (старый мозг) мышей.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В первой серии опытов испытывали стимулирующий эффект предварительно разведенных до 1:50 мозговых экстрактов, полученных от мышей разного возраста, на пролиферацию первично-трипсинизированных глиальных клеток Для этого весь пул пробирок с культурами делили на три части, первая из которых служила контролем, во вторую часть пробирок добавляли экстракт молодого мозга и в третью — экстракт старого мозга (табл. 1).
Таблица 1. Стимуляция пролиферации первично-трипсинизированных глиальных клеток мозга мышей мозговыми экстрактами мышей различного возраста
20. Bruce M. E., McBridge P. A., Jeffrey M. et al. — In: Alzheimers disease: advances in clinical and basic research. — N. Y. -1993. — P.481-487.
21. Damaimay R., Adjou К. Т., Beringue V. et al. — In: Transmissible subacute spongiform encephalopathies. Eds. L. Court &B. Dodet. Elsvier. Paris. -1996. — P.191 -197.
22. Sobel H. — Цит. по В. А. Зуев — Медленные вирусные инфекции человека и животных. М., Медицина. -1988. — С. 233 — 234.
